qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即(ji)實時熒光定量核酸擴增檢測系統,也叫實時定量基(ji)因(yin)擴增熒光檢測系統(tong),簡稱qPCR。廣泛用于特異性核酸的檢測。qPCR通常在標準的96孔板上(shang)進行,現在實驗室(shi)里的96孔(kong)板就像移液(ye)器和燒杯那樣常見。
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qPCR的基本步驟
NCBI里(li)的數據,為(wei)引物設計和功能分析帶來了方便,但是這些數據都是理論上的,實際實驗操作還(huan)要(yao)經過各種(zhong)的計算(suan)。不比(bi)擔(dan)心,有(you)心人(ren)已經把qPCR實驗中所用到的各種工具(ju)都“打包(bao)”了,比(bi)如(ru)Biosearch(//www.qpcrdesign.com/oligo-toolbox)這個網站里,就(jiu)有一個成套的qPCR工具箱Oligo Toolbox,其中包含的工具能做很多實(shi)驗計算工作。
OligoSpec? Calculator
OligoSpec? Calculator可以(yi)確(que)定(ding)引物或探針的特(te)定(ding)物理性質,比如可能(neng)擁有的5',3'或(huo)內(nei)部修飾(shi),甚(shen)至還(huan)有(you)熒光團(tuan)、黑洞(dong)淬滅基(ji)團(tuan)標記、生(sheng)物素標簽或(huo)修飾(shi)堿(jian)基(ji)。如(ru)果科研人員知(zhi)(zhi)道序列但是不知(zhi)(zhi)道分子(zi)量(MW),這個計算(suan)器(qi)也(ye)能(neng)派上用場,它還能(neng)把(ba)單(dan)位從“克(ke)”換算(suan)成“摩爾(er)”。此外,該工具還提供了260 nm處寡聚物的消光系數,可與(yu)濃(nong)度計(ji)算器(qi)一起定量濃(nong)度。
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qPCR Reaction Estimator
這個qPCR反應(ying)估計(ji)器(qi)可以用于計(ji)算小瓶引(yin)物或探(tan)針(zhen)實際上會持續多長時間。當然……是理論上,也可以來預估(gu)引物(wu)的(de)數量。輸入一些關于反(fan)應條件的(de)基本信息,以找出(chu)寡核苷酸(suan)可能執行的(de)反(fan)應次(ci)數。不過一些液(ye)體會因(yin)為移液(ye)而(er)丟失,所以實際的(de)反(fan)應次(ci)數會少于預估(gu)值。
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Oligo Resuspension Calculator
這個有用(yong)(yong)的小工(gong)具能用(yong)(yong)來計算水或TE緩沖液的確切體積(ji)來重(zhong)懸浮新加入(ru)的寡核苷酸(suan)(suan)。一些寡核苷酸(suan)(suan)廠家(jia)提(ti)供的說明書里只(zhi)會教你怎么在(zai)干粉(fen)引物里加稀釋劑(ji)來配100 μM的(de)濃(nong)度。但缺點(dian)也很(hen)明顯,限制(zhi)太大了(le),如果(guo)要準備不同濃(nong)度引物,那就(jiu)需要這(zhe)個(ge)計(ji)算器來幫(bang)你(ni)。由于多次(ci)凍(dong)融循環會促進(jin)寡聚體降解,因(yin)此可(ke)以考慮(lv)將您的(de)寡核苷酸(suan)分裝(zhuang)成一系列工作濃(nong)度的(de)等分試樣(yang)。
Oligo Dilution Calculator
類似上面(mian)的工(gong)具,也(ye)是一個(ge)非(fei)常簡單明了的計算器。對于數學苦手來說,qPCR中的(de)那些多任務計算實(shi)在是(shi)有(you)心無力,有(you)了(le)這個后日子就好過多了(le)。只要輸入寡(gua)核(he)苷酸的(de)濃(nong)度、所需(xu)的(de)最終濃(nong)度和體積(ji)和ta-da,它就能算出所需稀(xi)釋(shi)劑的(de)(de)(de)體積。稀(xi)釋(shi)計(ji)算器還有(you)一個有(you)用(yong)的(de)(de)(de)功能是貼(tie)心(xin)的(de)(de)(de)提供(gong)了(le)不同的(de)(de)(de)單位,再也不用(yong)擔(dan)心(xin)單位從(cong)皮摩爾轉換到微摩爾的(de)(de)(de)時候點錯(cuo)小數點了(le)。
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Concentration Calculator
引(yin)物(wu)濃度很重要(yao),但(dan)對于一管子未知的引(yin)物(wu),要(yao)計算濃度可(ke)不這么簡單(dan)。這個工具能在輸入260nm的光(guang)密(mi)度(在實驗室用分(fen)光(guang)光(guang)度計測(ce)量)或OligoSpec? Calculator算出(chu)的消光系數,就(jiu)能算出(chu)引(yin)物濃度,這是基于每(mei)個(ge)修(xiu)改和(he)基礎綜(zong)合值的估計。
當然消光系(xi)數(shu)260(ε260)用公式也(ye)能(neng)求,就(jiu)是比較煩。ε260 = [(所有堿(jian)基的ε260之和(he)) + (所有修(xiu)飾(shi)的ε260)] x 0.9,所有的(de)ε260值都以(yi)M-1?cm-1為單位。其(qi)中(zhong),dA (ε260=15,200),dC(ε260=7,050),dG(ε260=12,010),T(ε260=8400)。
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多重qPCR的光(guang)譜疊加工具
這個工具可以(yi)說是Oligo Toolbox里最大的特(te)色。這對于(yu)設計多重(zhong)qPCR實驗特(te)別(bie)有用,其需要用特(te)定熒光團(tuan)(染料)標(biao)記的(de)多(duo)(duo)個探針來檢測(ce)多(duo)(duo)個qPCR產(chan)物。基本上(shang),不同熒(ying)光團不能在相(xiang)同的(de)波長下發射激(ji)發。
該光譜疊加工具(ju)顯示(shi)每種可用熒(ying)光團和淬滅劑的吸收和發(fa)射光譜,允許(xu)用戶(hu)識別任何重(zhong)疊。該工具(ju)還考慮了染料與(yu)正在使(shi)用的qPCR系(xi)統(涵(han)蓋大多數制(zhi)造商(shang))的兼容性,因此可(ke)以為儀(yi)器找到最佳的熒光團和淬(cui)滅(mie)劑(ji)組。
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除了(le)工(gong)具箱(xiang)之外,在這(zhe)個網站上(shang),還(huan)能找到其他qPCR設計軟件(jian)和(he)一(yi)系(xi)列不斷更新(xin)的資源,包括參考(kao)論文以及所有與qPCR相關(guan)的(de)視頻和鏈接,安利一(yi)個。