【中(zhong)英文題目】
小(xiao)麥抗赤(chi)霉病基因Fhb1基因,編碼(ma)帶有凝集素結構域以及類(lei)毒(du)素成孔結構域的嵌合凝集素
Wheat Fhb1?encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight
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【基本(ben)信息】
期刊:NATURE GENETICS
年份:2016
IF: 32.197
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【摘要】
小麥赤霉病(bing)(FHB)是由鐮刀(dao)菌引起的,對麥(mai)(mai)類作物的破壞性極強(qiang),造成糧食嚴重減產,食用患病小麥(mai)(mai)的人畜會產生不良(liang)反應。隨著FHB在美國(guo)、加拿大、歐亞以及(ji)南非(fei)的相繼爆(bao)發,FHB已(yi)經成為全(quan)球關注的話題。在(zai)1993-2001年的美國,由于(yu)FHB造成的經濟損失大(da)約70.67億美元。大量研(yan)究表明,Fhb1基(ji)因是抗FHB的數量性狀位點(QTL),文章報道了關于中國小麥栽培種Fhb1基因的圖位克隆(long)技(ji)術。通過(guo)進行變異分析、基因沉默以及轉基因表達,發現Fhb1基因含有類毒素成孔結(jie)構域(PFT),具有(you)抗赤(chi)霉(mei)病(bing)的作(zuo)用,推測PFT編碼含有(you)兩個(ge)凝集素結構域和一個(ge)ETX/MTX2毒素結構域的嵌合(he)凝集素。
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【研究思(si)路】
取(qu)材(cai):
取抗性和(he)易感近同源系(xi)(R-NIL 260-1-1-2和(he)S-NIL 260-1-1-4)用于本次基(ji)因(yin)表達(da)研(yan)究(jiu)
取Kansas State University的41個地方種和栽培種的種子用于本次研究關聯分析(xi)
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文庫構建及(ji)測序策略(lve):
基于Sumai 3(蘇麥3號,含有Fhb1基因位(wei)點的(de)中國(guo)栽培種)構(gou)建BAC庫,基因覆蓋度~3×,插入(ru)序(xu)列的(de)平均長(chang)度~100 kb
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信息分析:
【研究結(jie)果】
1、對抗FHB的基(ji)因的進(jin)一步確定
Fhb1基因來自中國栽(zai)培(pei)種Sumai 3,是(shi)重(zhong)要(yao)的QTL位點,文(wen)章報道了Fhb1基(ji)因的定位克隆,之(zhi)前已經有研(yan)究將Fhb1基因的范圍縮(suo)小(xiao)到0.08cM,兩側(ce)的(de)DNA標記分別(bie)為STS3B-355和STS3B-334,本研究利用了同樣的標記物(wu),其(qi)他標記物(wu)來(lai)自CS(普通小麥中國春)?3BS,根據BAC末端標記篩(shai)選Sumai 3 BAC文庫。
文章通過指(zhi)紋法(fa)組裝了8個重(zhong)疊的BACs,并對4個BACs(476D8, 71I24, 383G12以及572D13)進行測序(xu),在(zai)Fhb1附近形成(cheng)兩個contigs(一(yi)共~350 kb),之后進一步組裝注釋(shi)。如圖1,對Sumai 3的(de)13個基因(yin)進行了(le)注釋。將Sumai 3的Fhb1區域與CS的3B和3D染色體的同源區域進行比較(jiao),發現Sumai 3的(de)Fhb1區域在(zai)基因成分和(he)長度上與3D染色體更為相似。
圖1 ?Fhb1對應(ying)表(biao)型以(yi)及(ji)map過程 ?(a)抗性和易(yi)感的近同源系(NILs)的穗(sui)表現出不同(tong)的FHB表型。相比R-NIL(抗性)的穗,S-NIL(易感)的穗發(fa)生(sheng)嚴重褪色;(b) S-NIL的被鐮刀霉損(sun)壞的(de)干(gan)癟的(de)谷粒與R-NIL飽滿健康的(de)(de)谷粒(li)的(de)(de)比較;(c) Sumai 3中Fhb1基因在染(ran)色體上(shang)的定位;(d)染色體上經3B 355和3B 334標記的0.08cm區間展(zhan)現出Fhb1基因的染(ran)色(se)體圖譜;(e) Sumai 3中(zhong)Fhb1基因(yin)的物(wu)理圖譜,包括(kuo)13個開放讀碼框(kuang)(箭(jian)頭表示(shi))及其對應(ying)位置。橙色線條表示(shi)不含基(ji)因的重(zhong)復區(qu)域,將編(bian)碼蛋白的基(ji)因分別進行標記:MT表示tRNA甲基化轉移酶;PG表示果膠(jiao)酶;NAD表示結合NAD的(de)氧化轉移酶;NBA含有(you)Nb-ARC結構域;TS表示類合成酶(mei);His表示富含組氨酸的鈣(gai)結(jie)合蛋白;HC表示類HCBT的防御應答蛋白(bai);PFT表示成(cheng)孔(kong)類毒素;Sin表示sina超家族;SG表示SGNH植物酶;Cys表示胱抑素;FB含有F-box結構域;帶星號的基因排除在Fhb1候選基因以(yi)外。(f)與CS 3DS的同源區域的比較(jiao);(g) 與CS 3BS的同源(yuan)區域的比較(jiao)。‘ζ’和‘ψ’分別表示基因片段和假(jia)基因;ψUDG表示假(jia)基因UDP-葡萄糖 6-脫氫酶。
為了確定抗FHB的基因,文章利(li)用實(shi)時定量PCR對麥穗中(zhong)的注(zhu)釋基因進行(xing)表達分(fen)析(xi),對于抗性近等位基因系(R-NIL)和易感(gan)近等位基因系(S-NIL)分別注入鐮刀(dao)霉和水。PFT基因和含Nb-ARC結構域的基因(yin)(NBA)只在R-NIL中表達,而(er)其他(ta)基因在兩(liang)種(zhong)NIL中均表達。此外,通過基因(yin)互補,將13個基因中的6個排除在外(圖1e),剩下的7個基因(yin)中,PFT基因和(he)NBA基因(yin)(yin)是已知的(de)在植物抗(kang)性中可能(neng)發揮(hui)主(zhu)要作(zuo)用的(de)基因(yin)(yin),因(yin)(yin)此,文章(zhang)針對(dui)這(zhe)兩個候選基因(yin)(yin)做了進一步的(de)基因(yin)(yin)結構(gou)和蛋白質序(xu)列的(de)預測。
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2、PFT基因的結(jie)構及突變分析
PFT基因(yin)全長(chang)3472bp,含有兩(liang)個外(wai)顯子(zi),最終產生1437bp的mRNA,cDNA末端(RACE)的隨機(ji)擴增表明PFT轉錄本含有(you)一個49bp的5’UTR區(qu)和216bp的3’UTR區(圖2a);預測蛋(dan)白(bai)含有478個氨基酸,并包含了兩個(ge)凝集(ji)素結構域和一個(ge)ETX/MTX2結構域(圖2b);此外,文章(zhang)中利用(yong)針對誘導(dao)基因組(zu)局部(bu)病變(TILLING)的方(fang)法來確定PFT的(de)候(hou)選基因。從1929個M2家系中篩選出30個突(tu)變(bian)體(ti),突(tu)變(bian)體(ti)pft1284, pft1958,?pft1409,?pft1700以及?pft528在(zai)純合子狀態下致使作物(wu)易感FHB(圖2a),另(ling)外,圖2c可以看到,易(yi)感(gan)(gan)突變體(ti)在被(bei)感(gan)(gan)染后麥穗發生嚴重脫色,但是(shi),HR58親本的麥(mai)穗則是健(jian)康的。除此(ci)之外,這些(xie)突變體(ti)還(huan)含有很高的脫氧(yang)雪腐鐮孢烯醇(DOH),麥穗也表(biao)現出很高比例的枯(ku)萎褪色,麥粒干癟缺水(圖2d);
圖(tu)2 PFT的基因結構和突變分析??(a)PFT基(ji)因含有兩(liang)個外顯子(橙色框)通過一(yi)個內含子(黑色線條(tiao))相連,兩(liang)頭的綠色框表示(shi)的是非(fei)編(bian)碼區,箭頭表示(shi)易感TILLING突(tu)變(bian);(b)PFT蛋白保守(shou)結構(gou)域的分析顯示含有兩(liang)個凝(ning)集素超家族結構(gou)域和一(yi)個ETX/MTX2超家族(zu)結構域,灰色(se)框利用(yong)數字標志了氨基酸的(de)位(wei)置;(c)易感的TILLING突變(bian)突變(bian)體被(bei)FHB感染后表現出嚴重(zhong)的(de)褪色現象,白色箭(jian)頭指向的(de)是(shi)接種位點;(d)突變體的鐮刀(dao)霉感染的谷粒與健康的抗(kang)性HR58親本的(de)(de)谷粒的(de)(de)比較(jiao)。
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3、RNAi誘導基(ji)因沉默來(lai)驗(yan)證(zheng)PFT基因的(de)功能
RNAi可以誘導基因沉默,文章對小麥栽培種Bobwhite中的PFT基因做RNA干擾,該(gai)品種適(shi)合進行轉化但(dan)是不含(han)有Fhb1(圖3a),而含有Fhb1的Sumai 3和R-NIL則不適用(yong)于組織培養,因此(ci)不適合進行(xing)轉化。圖3b可以看到,R-NIL和Bobwhite(未轉(zhuan)化)雜(za)交得到的(de)F1代植株可以抗FHB病;定量PCR結果表(biao)明,PFT的表(biao)達在(zai)R-NIL-RNAi F1代植株的麥穗(sui)中的表達比(bi)R-NIL-Bobwhite植株至少減少150倍(圖3e),Fhb1抗性株往(wang)往(wang)攜帶有(you)PFT基(ji)因。
圖3 RNAi誘導基因(yin)沉默來驗證PFT基因的功能??(a)用于轉化實驗的PTF基因經過自補RNAi構建的結(jie)構示(shi)意圖;(b)經RNAi誘導以及鐮(lian)刀(dao)霉交叉(cha)感(gan)染的發白(bai)的麥(mai)穗與未進行(xing)RNAi的綠色的麥穗的比較示意圖,F1 R-NIL與RNAi Bobwhite雜交后麥穗嚴重褪色,易感Bobwhite和RNAi Bobwhite雜交結果也是如此,但是R-NIL與未進行RNAi的親本雜交得到的卻是綠色的麥穗(中間),圖中黑色的點(dian)就是感染位點(dian);(c) 經RNAi誘(you)導以及鐮刀霉交叉(cha)感(gan)染(ran)的發白的麥粒與未進行RNAi的綠色的麥粒的比較示意(yi)圖(tu),F1 R-NIL與RNAi Bobwhite雜交后麥(mai)粒干癟發(fa)白,但是R-NIL與未進行RNAi的親本雜交得到的卻是健康的種子(zi);(d)反轉錄PCR發現只在轉(zhuan)基因系中進行RNAi(第一個膠);PFT基因在非轉基因對(dui)照組中表達,但是在RNAi系中表達受到抑制(第二(er)個膠);肌(ji)動蛋白則(ze)證明mRNA在所(suo)有(you)樣本中(zhong)均(jun)有(you)表達(最后一個膠);(e)對F1植株開花前期的麥穗(sui)做定(ding)量PCR發現相比未進行RNAi的樣本(ben),進行(xing)RNAi的樣本至少減少了(le)150倍。
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【研究(jiu)結論】
文(wen)章通過進行變異分(fen)析、基因(yin)沉默以及轉基因(yin)表(biao)達(da),發現(xian)Fhb1基因(yin)含(han)有(you)類毒素(su)成(cheng)孔結(jie)構(gou)域(PFT),具有(you)抗赤霉病(bing)的(de)作用,推測PFT編碼含(han)有(you)兩個(ge)凝(ning)集素(su)結(jie)構(gou)域和一個(ge)ETX/MTX2毒素(su)結(jie)構(gou)域的(de)嵌(qian)合凝(ning)集素(su)。
Fhb1的序列信息有利于在標記(ji)輔助育種中(zhong)涉(she)及更好(hao)的標記(ji)物,為FHB疾病多基因聚合(he)和(he)基因工程提(ti)供長(chang)遠經濟的解決思路。